摘要：研究油茶籽壳中总黄酮类物质的提取工艺，探讨影响提取率的主要因素，通过正交试验确定提取工艺。通过DPPH法﹑FRAP法﹑·OH清除能力3个体系对不同溶剂提取物的体外抗氧化能力进行研究。试验结果表明：在30倍样重的60%乙醇中浸泡后，40℃下超声波辅助萃取45min，油茶籽壳中的总黄酮提取率为1.71%。此外，不同溶剂提取物中黄酮提取率差异很大。在DPPH体系中，油茶籽壳60%乙醇提取物的IC50为781μg/mL，清除能力于其它溶剂提取物与对照品竹叶提取物(IC50为1025μg/mL，主要成分为竹叶黄酮)(P<0.05);60%乙醇提取物的FRAP值为1.79mmol/L，显示出与竹叶提取物相当的还原能力;在清除羟自由基(·OH)体系中，样品质量浓度为500μg/mL时，乙醇提取物的清除效果与竹叶提取物相当;当样品质量浓度为1000μg/mL时，乙醇提取物的清除效果稍弱于竹叶提取物。

　　关键词:油茶籽壳;总黄酮;提取溶剂;抗氧化

　　油茶(camelliaoleifera)是我国特有的木本食用油料树种[1]，其果实油茶籽生长周期长，从开花到采摘，历经冬﹑春﹑夏﹑秋四季，民间素有“抱子怀胎”之称。茶果中，茶蒲占60.0%~61.3%，茶籽占38.7%~40%，茶籽中壳占30.6%~34%，茶仁占66.0%~69.4%。我国油茶资源十分丰富，据统计，有油茶36.67万hm2(5500万亩)[2]，每年产油150万t，这将带来1000多万t的油茶籽壳。如此庞大的数量的副产物，若能加以有效利用，将能产生巨大的经济效益。国外曾有从油茶籽油不皂化物中分离三萜醇以及从茶籽饼中分离黄酮和黄酮醇苷[3]的报道。国内有油茶总皂苷具有抗氧化及清除自由基的能力[4]以及茶籽毛油中存在性抗氧化物质[5]的报道，但从油茶籽壳中提取黄酮并对其进行抗氧化研究截至发稿前未见报道。黄酮类化合物是一类在植物界广泛分布的多酚类天然产物。有研究表明，黄酮类化合物具有抗氧化、抗癌、抗心脑血管疾病、抗炎、抗病毒、疫调节等多种生理功能及药理作用，其提取物已用于食品、药品、化妆品等中[6]。因此开发利用油茶壳中的黄酮类化合物具有重要的现实意义。为了利用油茶壳中的黄酮类物质，本文借助超声波辅助萃取油茶籽壳总黄酮，通过1，1-二苯基-2-苦基苯肼(DPPH·)法﹑铁离子还原法(FRAP)与羟自由基(·OH)清除能力3个反应体系来评价其抗氧化能力，为油茶籽壳中有效成分的开发利用提供参考。

　　1材料与方法

　　1.1材料油茶籽，2006年11月份采购。将油茶籽敲碎，分离的油茶壳晒干，用粉碎机粉碎，过40目筛。

　　芦丁标准品，医药上海化学试剂公司;竹叶提取物(黄酮含量：32%)，浙江安吉圣氏生物制品有限公司;1，1-二苯基-2-苦基苯肼自由基(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)(DPPH);无水乙醇、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝等均为分析纯试剂。

　　1.2仪器

　　7530G分光光度计，惠普上海分析仪器公司出品;KQ-250B型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司出品;电动粉碎机，温岭市大德中药机械有限公司出品。

　　1.3试验方法1.3.1油茶籽壳总黄酮的工艺流程及乙醇提取优化油茶籽壳总黄酮工艺流程：油茶籽壳→晒干→粉碎→溶剂浸泡→超声波辅助萃取→抽滤→定容→定量分析。

　　准确称取1.0g油茶籽壳粉于50mL三角烧瓶中，加入一定量的乙醇，在一定温度下超声波提取一定时间，趁热减压抽滤，用相应浓度的乙醇溶液定容于50mL容量瓶中，即为待测液。

　　1.3.2油茶籽壳总黄酮的分级提取选用性由弱到的4种溶剂———石油醚、纯乙醇、60%乙醇、水，分别提取油茶籽壳中的总黄酮。具体操作：准确称取8.0g油茶壳粉于500mL三角瓶中，按物料比1：30加入提取溶剂，50℃下超声波提取45min，趁热减压抽滤，用相应浓度的溶液定容于300mL容量瓶中，即为待测液。

　　1.3.3总黄酮标准溶液的制备和标准曲线绘制以五氧化二磷为干燥剂，减压干燥(60℃，0.09MPa)至恒重的芦丁标准品0.077g，用60%乙醇溶解，定容至250mL，摇匀，得0.2926mg/mL的标准液，放入低温暗箱内，及时检测。分别吸取标准液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL于25mL容量瓶中，用60%乙醇添至10mL，加入5%NaNO2溶液1.0mL，摇匀，放置6min，再加入10%Al(NO3)3溶液1.0mL，6min后加入4%NaOH溶液10mL，混匀，用30%乙醇定容至刻度，摇匀，放置15min后，在波长510nm处测定吸光度A，得芦丁含量y(mg/mL)与吸光度A之间的回归方程为：y=0.113A+0.0016(R2=0.9993)。

　　1.3.4提取物总黄酮的测定取本文1.3.2节中待测液1mL于25mL容量瓶中，其它操作同1.3.3节，测定其在510nm处的吸光度A。由回归方程计算黄酮提取率。

　　总黄酮提取率(%)=[黄酮类化合物质量(g)/原料质量(g)]×100%得率(%)=[提取物质量(g)/原料质量(g)]×100%提取物干基黄酮含量(%)=[黄酮类化合物质量(g)/提取物质量(g)]×100%1.3.5抗氧化能力的测定方法1.3.5.1清除DPPH·活性的研究[7-8]准确称取DPPH·2.5mg，用甲醇定容到100mL，使用时稀释为不同浓度，测定515nm波长处的吸光度，制作标准曲线。DPPH·残留率的计算公式：[DPPH·]REM=[DPPH·]T/[DPPH·]T=0×100%式中，[DPPH·]REM———DPPH·残留率(%);[DPPH·]T———为自由基清除过程中某一时刻DPPH·的质量浓度(μg/mL);[DPPH·]T=0———DPPH·的原始质量浓度(μg/mL)。

　　1.3.5.2FRAP法测定提取物的抗氧化活性参照Benzie与Strain的方法[8]。操作步骤：取适量提取物溶液，加入1.8mLTPTZ工作液(由0.3mol/L醋酸盐缓冲液25mL、10mmol/LTPTZ溶液2.5mL、20mmol/LFeCl3溶液2.5mL组成)，混匀后37℃反应10min，测定波长593nm处溶液的吸光度。由吸光度的大小判断溶液的还原能力。试样还原活性(FRAP值)以达到同样吸光度所需FeSO4的毫摩尔数表示。FRAP值越大，表明样品的还原能力越，即抗氧化活性越。

　　1.3.5.3清除羟基自由基(·OH)试验[9]反应体系：1mL8.8mmol/LH2O2、1mL9mmol/LFeS-O4、1mL9mmol/L水杨酸-乙醇、各种浓度的油茶籽壳提取物溶液1mL。在反应体系中加入H2O2启动反应，37℃反应0.5h，以蒸馏水为参比，在波长510nm处测定各浓度的吸光度。考虑到油茶籽壳提取物溶液本身的吸光值，以1mL9mmol/LFeSO4、1mL9mmol/L水杨酸-乙醇、1mL不同浓度的油茶籽壳提取物溶液和1mL蒸馏水作为油茶籽壳提取物溶液的本底吸收值。清除率计算公式：清除率(%)=[AO-(AX-A′O)]/AO×100式中：AO———空白对照液的吸光度;Ax———加入油茶籽壳提取物溶液后的吸光度;A′O———不加显色剂H2O2油茶籽壳提取物溶液本底的吸光度。

　　2结果与分析

　　2.1油茶籽壳总黄酮提取工艺参数的优化在单因素试验基础上，对影响油茶壳总黄酮提取率的因素：乙醇浓度、料液比、超声波提取温度、提取时间做L9(34)正交试验，研究油茶籽壳总黄酮提取工艺。

　　表2中的数据表明，各因素对总黄酮提取效果影响顺序依次为乙醇浓度>料液比>提取温度>提取时间。通过正交试验、方差分析及各个处理间差异显著性检验，4种因素的组合为A2B3C1D3，即60%乙醇，温度40℃，料液比1：30，超声波提取45min。在此条件下测得油茶壳中总黄酮的提取率为1.71%。

　　2.2油茶籽壳不同溶剂提取物中的总黄酮提取率从表3可以看出，不同溶剂提取的总黄酮含量差异很大。对于油茶壳，采用60%乙醇提取的黄酮提取率为1.60%，其次是水提取液、乙醇提取液和石油醚提取液。采用石油醚提取的黄酮提取率仅为0.23%，约为60%乙醇提取液的1/7。此外，60%乙醇提取物干基黄酮含量为42%，显著高于其它溶剂的提取物(P<0.05)。

　　2.3清除DPPH·活性的研究2.3.1标准曲线及回归方程按照本文1.3.5.1节中测定方法配制不同梯度浓度的DPPH·溶液，于波长515nm处测定吸光值。以吸光度(A)对质量浓度(c)制作DPPH·标准曲线，计算出回归方程A=0.025c+0.0009，相关系数R2=0.9998。

　　2.3.2不同提取物清除DPPH·能力比较从图1～图5可见，对于油茶籽壳的各提取物而言，随着提取物浓度的增加，DPPH·残留率明显降低。其中石油醚提取物与水相提取物的清除能力相对弱一些，当其质量浓度从400μg/mL升至2000μg/mL时，才逐渐显示出一定的清除效果。60%乙醇提取物、纯乙醇提取物与竹叶提取物的清除效果较好，在提取物浓度同为1200μg/mL时，DPPH·残留率分别为26.4%、28.5%和41.7%，比石油醚与水相提取物的清除能力很多。60%乙醇提取物与纯乙醇提取物的清除能力好于对照样品--竹叶提取物。因此油茶籽壳提取物具有良好的清除自由基能力。此外，60%乙醇提取物与乙醇提取物清除DPPH·的速度较快。在DPPH·溶液中加入乙醇提取物或60%乙醇提取物后，DPPH·残留率在1min内迅速下降，5min左右达到稳定。此后随着时间的延长，DPPH·残留率变化很小。其它溶剂提取物属于慢速抗氧化剂，添加后30min左右DPPH·残留率才达到稳定。

　　2.3.3不同溶剂提取物与竹叶提取物的IC50值比较根据图1～图5各种抗氧化剂的自由基清除曲线(又称抗氧化曲线)，经计算得到抗氧化剂浓度与自由基残留率关系的线性回归方程，并由此求出半抑制浓度IC50。在200～2000μg/mL范围，油茶籽壳的各提取物和竹叶提取物清除DPPH·自由基的能力随其质量浓度的增加而提高。由表4可以看出，清除DPPH·能力的次序为60%乙醇提取物﹥纯乙醇提取物﹥竹叶提取物﹥水提取物﹥石油醚提取物，其中60%乙醇提取物在清除DPPH·的试验中表现出良好的效果，其IC50值为781μg/mL，低于对照竹叶提取物(1025μg/mL)，且明显低于其它各提取物(P<0.05)。此外，由于石油醚提取物溶解性的原因，其清除DPPH·的效果有待于进一步研究。

　　2.4铁离子还原(FRAP法)的试验结果2.4.1标准曲线及回归方程配制不同浓度梯度的FeSO4待测液，于波长593nm处测定吸光值，以吸光度(A)对FeSO4浓度(c)制作DPPH·标准曲线，计算出回归方程为A=0.0006c+0.0357，相关系数R2=0.991。

　　2.4.2不同溶剂提取物与竹叶提取物的抗氧化活性比较由表5可以看出，在FRAP的测试体系中，各样品的还原活性次序为竹叶提取物﹥60%乙醇提取物﹥水提取物﹥纯乙醇提取物﹥石油醚提取物。其中竹叶提取物与油茶籽壳60%乙醇提取物的还原性相当，与DPPH体系的试验结果相同。说明性偏大的溶剂提取物也具有一定的抗氧化效果。

　　2.5清除羟自由基(·OH)的试验结果由图6可知，油茶籽壳的各溶剂提取物与竹叶提取物对羟自由基均有一定的清除作用。样品浓度对油茶籽壳纯乙醇提取物和竹叶提取物清除羟基自由基的能力影响很大。随浓度的升高，它们清除羟基自由基的作用增。油茶籽壳纯乙醇提取物与竹叶提取物在样品质量浓度为500μg/mL时清除率相当，分别为39.1%和40.9%，高于油茶籽壳水提物(22.9%)(P<0.05)。这与DPPH、FRAP体系试验结果一致。

　　3结论

　　通过单因素及正交试验得出油茶籽壳总黄酮的提取工艺条件：在30倍于样重的60%的乙醇溶液中浸泡30min，40℃下超声波提取45min，油茶籽壳中总黄酮类化合物提取率高达1.71%。通过DPPH法、FRAP法与清除羟自由基3个试验体系研究油茶籽各提取物的抗氧化性，结果表明：油茶籽壳各提取物的抗氧化能力与其浓

　　度相关。在3个试验体系中油茶籽壳60%乙醇提取物、纯乙醇提取物显示出良好的抗氧化与清除自由基能力，与对照品竹叶提取物相当。因此，油茶籽壳提取物作为一种有效的自由基清除剂，具有很好的应用前景。